Настоящее сообщение посвящено методам определения белка в моче и спинномозговой жидкости (СМЖ) и информирует о наборах реагентов, производимых в ЗАО "Вектор-Бест" с этой целью.

Определение в моче белка, глюкозы, креатинина, кальция, амилазы, мочевой кислоты, кетонов и других аналитов используется для диагностики многих заболеваний. Наиболее массовым анализом является определение белка, имеющее большое значение для выявления заболеваний почек и мочевыводящих путей. Наличие белка в моче в концентрациях, превышающих нормальный уровень, называется протеинурией. Различают физиологическую и патологическую протеинурию. К физиологической протеинурии относятся случаи временного появления белка, не связанные с заболеванием, - после физических нагрузок; приема большого количества пищи, богатой белками и др. Патологические протеинурии подразделяют на почечные и внепочечные. При внепочечных протеинуриях содержание белка в моче не превышает 1 г/л; они наблюдаются при циститах, пиелитах, простатитах, уретритах, вульвовагинитах. Почечная протеинурия характеризуется содержанием белка в моче, превышающем 1 г/л, и наблюдается при острых и хронических гломерулонефритах и пиелонефритах; нефропатии беременных; выраженной хронической сердечной недостаточности; амилоидозе почек; липоидном нефрозе; туберкулезе почек; выраженной анемии; гипертонической болезни [1, 2].

Исследование белка в СМЖ имеет важное диагностическое значение при заболеваниях центральной нервной системы и мозговых оболочек, таких как энцефалиты (воспаление головного мозга), менингиты (воспаление твердой мозговой оболочки), арахноидиты (воспаление паутинной оболочки), сифилис мозга, нарушение мозгового кровообращения, опухоли, травмы. При наличии острого воспаления в СМЖ повышается фракция б-глобулинов; при хроническом - в- и г-глобулинов. Повышение уровня белка в СМЖ может быть вызвано туберкулезным гнойным и серозным менингитами; нарушением гемодинамики; опухолями мозга; полиомиелитом; травмами головного мозга с субарахноидальным кровоизлиянием; нефритом с уремией; сифилитическим параличом, а также наблюдается после проведения операций на мозге [1, 2].

Для определения белка в СМЖ и моче в клинико-диагностических лабораториях (КДЛ) иногда еще применяют метод Брандберга-Робертса-Стольникова. В основе его - использование кольцевой пробы Геллера, заключающейся в том, что при добавлении азотной кислоты к исследуемой моче или СМЖ, содержащих белок, происходит его коагуляция, и на границе моча (СМЖ) - кислота появляется белое пятно [3]. Однако данный метод не позволяет проводить количественное определение белка, поэтому его применение весьма ограничено.

Одним из способов количественного определения белка в моче и СМЖ является турбидиметрический метод, основанный на преципитации белка сульфосалициловой кислотой (ССК). В силу дешевизны реактива ССК и возможности приготовления рабочего реагента в лабораторных условиях данный метод используют около 90% КДЛ России.

В ЗАО "Вектор-Бест" был разработан набор реагентов "Белок-ССК-Ново" и организовано его промышленное производство. Для изготовления данного набора используется очищенная ССК, поскольку, как показали наши исследования, от её качества зависит и чувствительность, и воспроизводимость результатов определения белка. Кроме того, были стандартизованы условия проведения некоторых стадий анализа. Выполнение приведённых ниже рекомендаций при использовании набора реагентов "Белок-ССК-Ново" в КДЛ обеспечивает стабильное получение воспроизводимых результатов:

1. Температура проведения реакции - 18-25°С.
2. Время проведения реакции - 20-25 мин (при меньшем или большем времени реакции определяемая концентрация белка занижается).
3. Реакционную смесь перед замером не перемешивать, а аккуратно переносить в кювету.
4. Концентрацию белка рассчитывать по калибровочному графику, построенному на логарифмической бумаге, так как зависимость оптической плотности от концентрации белка не линейна.
5. Использовать кюветы с длиной оптического пути 10 мм, а длину волны в диапазоне 590-620 нм.

Хотя метод ССК в настоящее время широко применяется в лабораторной практике, он имеет ряд существенных недостатков: низкую специфичность, чувствительность и воспроизводимость. Использование стандартного серийно выпускаемого набора реагентов <Белок-ССК-Ново> и полное соблюдение рекомендаций по его применению позволяет снизить аналитическую погрешность определения белка до 10%. Однако устранить её полностью не удаётся, так как погрешность анализа обусловлена самим методом ССК. Основными источниками ошибок при использовании данного метода являются: низкая устойчивость комплекса, образующегося при взаимодействии белка с ССК; сложная, нелинейная зависимость интенсивности мутности реакционной смеси от концентрации белка; значительное влияние некоторых компонентов мочи на результаты определения белка, за счет сильного разбавления реагента (отношение объёмов анализируемой пробы мочи и раствора ССК - 1:3); существенные различия в белковом составе калибратора и анализируемой пробы мочи; неполная преципитация ряда белков анализируемой пробы, приводящая к заниженному результату определения общего белка [4-6].

Альтернативой методу ССК являются колориметрические методы, основанные на связывании белка с органическими красителями. Начиная с 80-х годов прошлого столетия эти методы активно внедряются в лабораторную практику, при этом чаще всего в качестве красителей используют кумасси бриллиантовый голубой (КБГ), бромфеноловый синий (БФС) и пирогаллоловый красный (ПГК). Белки пробы взаимодействуют с сульфогруппами красителей, образуя комплекс белок-краситель, интенсивность окраски которого пропорциональна концентрации белка в исследуемом растворе.

За 20 лет использования колориметрические методы завоевали всеобщее признание благодаря простоте и быстроте исполнения, высокой чувствительности, хорошей воспроизводимости результатов, достаточно широкому диапазону линейной зависимости оптической плотности от концентрации белка в пробе. Нижний предел определения белка при использовании КГБ: ~1,5 мг/л; БФС ~10 мг/л и ПГК ~20 мг/л; линейная область определения концентрации белка с КГБ до 0,5 г/л; БФС - до 1,0 г/л; ПГК - до 2,0 г/л; время, затрачиваемое на анализ, - 5-15 мин.

Наряду с несомненными достоинствами колориметрические методы имеют недостатки, главным из которых является то, что способность применяемых красителей образовывать комплексы с различными белками варьирует. Следствие этого - снижение правильности определения общего белка в анализируемой пробе. Установлено, что органические красители лучше всего связываются с альбумином, основным белком мочи, и значительно слабее с глобулинами. Поэтому БФС, практически не образующий комплексов с глобулинами, может использоваться только для определения альбумина. Это, вероятно, является основной причиной того, что метод определения белка в моче с использованием БФС не получил широкого распространения. Однако подобранные в результате исследований модифицированные условия применения КГБ и ПГК для анализа мочи и СМЖ позволяют выровнять поглощение различных белков и тем самым повысить правильность определения общего белка в анализируемых пробах [7-12].

Метод с использованием КБГ был применен в лабораторной практике для определения белка в моче и СМЖ одним из первых. Однако высокая адсорбция красителя на стенках кювет, а также узкая линейная область определения белка в анализируемой пробе ограничили применение этого метода для рутинных лабораторных исследований (в том числе, и с использованием биохимических анализаторов).

Метод, основанный на применении ПГК, лишен этих недостатков и в настоящее время широко внедряется в лабораторную практику, особенно за рубежом. Этому способствует наличие большого числа соответствующих коммерческих наборов реагентов, производимых такими известными фирмами, как "Bayer Diagnostics", "Beckman", "Biocon Diagnostic", "Biodirect", "Bio-Rad", "Kone", "Merck", "Randox", "Serono", "Sentinel CH", "Sigma".

В ЗАО "Вектор-Бест" также был разработан и серийно производится набор реагентов для колориметрического определения белка в моче и СМЖ с пирогаллоловым красным "Белок-ПГК-Ново". В его состав входят готовый к использованию монореагент и калибратор белка, содержащий 70% альбумина и 30% глобулина. Несомненным достоинством набора является то, что используемое при анализе разведение пробы 1:50 (20 мкл мочи на 1 мл реагента) практически не приводит к разбавлению реагента и тем самым максимально снижает влияние матрикса исследуемой пробы на результаты определения белка. Установлено, что при таком разведении реагента интерференция всех компонентов мочи не превышает 2% [12].

Оптическая плотность растворов комплекса белок-ПГК в значительной степени зависит как от значения рН реагента, так и его состава, который обычно является коммерческой тайной фирмы-производителя коммерческого набора. Различный состав реагентов в наборах разных фирм и белковый состав калибраторов, используемых для расчета концентрации определяемого белка, приводят к тому, что область нормальных величин белка в моче отличается для наборов различных производителей ("Biocon" - до 0,12 г/сут; "Sigma", "Chronolab", "DiaSys", "Bio-Rad" - до 0,14 г/сут). В инструкциях к наборам реагентов других фирм-производителей область нормальных величин белка в моче имеет иную размерность, например, "Sentinel" - до 0,15 г/л [4, 13-17].

Исследования, проведённые сотрудниками ЗАО "Вектор-Бест", позволили подобрать оптимальный состав реагента набора "Белок-ПГК-Ново", который обеспечил его стабильность в течение всего срока годности, высокую чувствительность анализа, а также правильное и воспроизводимое получение результатов определения белка в моче и СМЖ.

Важной характеристикой набора реагентов, применяемого для определения белка в моче (а его концентрация обычно невысока), является разность между величинами оптической плотности (ОП) комплекса белок-ПГК и ОП самого реагента (холостой пробы). Чем выше эта разность, тем большая вероятность получения с использованием данного набора надежных и воспроизводимых результатов анализа. Мы сравнили величины ОП реагентов из различных коммерческих наборов и соответствующих комплексов белок-ПГК, полученные при использовании одинаковой концентрации альбумина (1 г/л) (табл. 1).

Как видно из табл. 1, наибольшая величина разности ОП комплекса белок-ПГК и реагента наблюдается для набора производства ЗАО "Вектор-Бест" 'Белок-ПГК-Ново".

Результаты определения белка в контрольных растворах мочи и СМЖ фирмы "Bio-Rad" набором с ПГК производства этой фирмы и аналогичным коммерческим набором реагентов ЗАО "Вектор-Бест" показали, что концентрация белка в контрольных растворах мочи и СМЖ определена правильно с помощью наборов обеих фирм, а её величина укладывается в диапазон аттестованных значений (табл. 2).

На следующем этапе исследований анализ 47 проб мочи и 30 проб СМЖ с повышенным содержанием белка (патологические образцы) был проведён с использованием наборов реагентов с ПГК различных фирм-производителей. Для расчета содержания белка в анализируемых пробах использовали единый калибратор белка производства ЗАО "Вектор-Бест", содержащий 70% альбумина и 30% глобулинов, в концентрации 1 г/л, а также калибраторы, входящие в состав каждого из сравниваемых наборов. При этом в первом случае количество образцов мочи, содержащих белок выше нормы, выявленное наборами реагентов четырех фирм-производителей, практически совпало (табл. 3).

При использовании калибраторов, входящих в состав каждого набора, отличия в результатах выявления образцов мочи с патологическим содержанием белка - более значимые. Это может быть связано с тем, что калибраторы к этим наборам имеют разный белковый состав, с различной степенью соответствия составу белков мочи. Поэтому результаты анализа одних и тех же проб мочи, проведённые с помощью четырех наборов реагентов, не совпадают: наблюдается как неполное выявление образцов мочи с патологическим содержанием белка (набор фирмы "Biocon"), так и получение ложноположительных результатов (набор фирмы "Chronolab"). Применение же для расчета концентрации белка единого калибратора, имеющего состав белков, близкий к белковому составу мочи, позволяет получить при анализе с использованием всех четырёх наборов более корректные и совпадающие результаты.

Количество патологических образцов СМЖ, выявленных с помощью четырех сравниваемых наборов при использовании как единого калибратора, так и калибраторов к наборам, совпало. Это объясняется тем, что белковый состав различных образцов СМЖ более однороден, и они в отличие от проб мочи практически не содержат интерферирующих соединений. Кроме того, нормальная концентраций белка в СМЖ в 4-5 раз выше, чем в моче, а ошибка определения белка при анализе проб с высоким его содержанием значительно ниже.

Таким образом, разработанный в ЗАО "Вектор-Бест" набор 'Белок-ПГК-Ново" сравним по правильности определения белка в моче и СМЖ с наборами реагентов фирм "Biocon", "Bio-Rad" и "Chronolab".

Мы также сравнили характеристики двух наборов реагентов собственного производства: "Белок-ПГК-Ново' (количественное определение белка в моче) и "Белок-ССК-Ново" (количественное определение белка в моче и СМЖ) (табл. 4).

Выбор любого из этих двух наборов для применения в КДЛ может определяться аналитическими характеристиками наборов, задачами, стоящими перед данной лабораторией, а также её оснащенностью необходимым оборудованием.

Ниже представлен весь комплект наборов реагентов, выпускаемый в настоящее время в ЗАО 'Вектор-Бест", для определения компонентов мочи; некоторые из них применяются также для анализа сыворотки крови (табл. 5).

Кроме того, ЗАО "Вектор-Бест" выпускает наборы калибровочных образцов (табл. 6), предназначенные для построения калибровочных графиков, контроля точности измерений, проверки правильности работы фотометрического оборудования, определения линейной области измерения компонентов мочи.

Для контроля правильности и воспроизводимости результатов определения белка, глюкозы, кетонов и величины рН в моче производятся также наборы контрольных растворов мочи двух уровней концентраций данных компонентов "Мочевой контроль-Ново" (№ по каталогу В-8208, -8212; табл. 7).

Применение в клинико-диагностических лабораториях полного комплекта наборов, выпускаемых ЗАО "Вектор-Бест" для определения компонентов мочи и спинно-мозговой жидкости, позволяет получать надёжные результаты анализа и проводить высококачественные лабораторные исследования.

1. Энциклопедия клинических лабораторных тестов / Под ред. Н. Тица. М.: Лабинформ, 1997. С. 76-77.
2. Назаренко Г.И., Кишкун А.А. Клиническая оценка результатов лабораторных исследований, М.: Медицина, 2000. 74 с.
3. Медицинские лабораторные технологии. Справочник (в двух томах) / Под ред. А.И. Карпищенко, СПб.: Интермедика, 1998. Том 1. С. 163.
4. Козлов А.В., Слепышева В.В. // Сб. трудов VII ежегодн. Санкт-Петербургского нефрологического семинара. СПб.: ТНА-1999. С. 17-18.
5. Инструкция к набору "Ultra-Sensitive Proteins Pyrogallol Red Method", "Biocon Diagnostik", Germany.
6. Альтшулер Б.Ю., Раков С.С., Ткачев Г.А. // Вопр. мед. химии. 2001. № 4. С. 1-13.
7. Загребельный С.H., Пупкова В.И. Количественные методы определения белка. Обзорная информация ВНИИ СЭНТИ. М., 1986.
8. Шишкин С.С. // Вопр. мед. химии. 1986. № 5. С. 134-141.
9. Orsonneau J.-L., Duet P., Massoubre C. et al. // Clin. Chem. 1989. V. 35. № 11. P. 2233-2236.
10. Lefevre G., Bloch S., Le Bricon T. et al. // J. Clin. Lab. Anal. 2001. V. 15. № 1. P. 40-42.
11. Fujita Y., Mori I., Kitano S. // Bunseki Kagaku. 1983. V. 32. P. 379-386.
12. Watanabe N., Kamei S., Ohkubo A. et al. // Clin. Chem. 1986. V. 32. № 8. P. 1551-1554.
13. Каталог фирмы "Sigma", "Protein, Total, Microprotein-PR". 2001. C. 2697.
14. Инструкция к набору "Pyrogallol Red Tota Protein Test Kit", "Bio-Rad Laboratories GmbH", Germany.
15. Инструкция к набору "Reagenz fur die quantitative in vitro - Bestimmung von Gesamteiweib in Urin oder Liquor an photometrischen Sestemen Gesamteiweib UC FS", "Diagnostic Systems GmbH", Germany.
16. Инструкция к набору "Urine Proteins. Pyrogallol Red direct colourimetric determination of total proteins in urine", "Sentinel CH", Italy.
17. Инструкция к набору "Total Protein in urine and CSF Pyrogallol-red", "Chronolab AG", Switzerland.